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gene cloningrt-pcr大熊猫合作学习基因表达基因克隆栖息地小组协作学习兴趣序列分析原核表达

大熊猫（Ailuropoda melanoleuca）是我们国特有的珍稀濒危动物，具有极高的科研和观赏价值。四川大学生命科学学院的张义正教授的研究组在大熊猫基因克隆研究方面取得了一些重要的进展。

据了解，除了栖息地的破坏和减少外，低下受孕率是导致大熊猫濒危的重要因素之一，而受孕率高低与精卵融合能力直接相关。

之前的研究已经知道，CD9基因在精卵质膜相互作用中具有重要作用，属于4次跨膜蛋白超家族的成员。CD9缺失的小鼠的卵细胞不能与精子融合，而将小鼠CD9 mRNA注射入小鼠卵细胞后，能够恢复小鼠精卵融合的活性。

为弄清大熊猫受孕率低是否与CD9基因相关，张教授的研究组对大熊猫CD9基因的结构及其表达产物生物学活性进行了研究。

研究组利用RT-PCR从大熊猫的卵巢组织克隆到大熊猫CD9(gpCD9)基因，CD9基因的编码区全长681 bp，编码226个氨基酸残基，分子量约25kDa。大熊猫的CD9氨基酸序列与其他动物相比，具有较高的保守性，其中与猫CD9同源性为91%，与人CD9的同源性为89%，与小鼠的CD9同源性为87%。

为检测大熊猫CD9基因在精卵融合过程中的功能区，他们还利用PCR将大熊猫CD9基因大胞外环进行定点突变，使其3肽序列TVT(173～75)突变为AAA。突变位点经测序证实，与鱼鳍结果相符。研究组利用PCR方法分别从大熊猫CD9基因及其突变型基因和小鼠CD9基因扩增到大胞外环（large extracellular loop，LEL）编码序列，并分别命名为gpLEL、gpLELm、mLEL——它们均编码83个氨基酸残基，分子量约为9.5kDa。

接着，研究组将3个大胞外环序列分别克隆到原核表达在途pET32a，成功构建了3个表达质粒，命名为pET-gpLEL、pET-gpLELm、pET-mLEL。将它们分别转化为大肠杆菌BL21(DE3)，对表达的3个融合蛋白进行SDS-PAGE分析，并获得了1条28kDa的特异蛋白带——这与推测的蛋白质大小相符。然后，他们利用HPLC（高效液相色谱）对融合蛋白进行纯化，最终获得了3种纯化蛋白质。

另外，研究组还从6到8周龄的雌鼠获得超排的卵细胞；从10－12周龄的雄鼠体内获得精子。然后，将去透明带卵细胞先与3种蛋白质分别共同温育30分钟后，将获能精子进行体外受精。

实验结果表明，gpLEL和mLEL严重抑制小鼠受精，而gpLELm则对受精的影响较小。这些发现意味着大熊猫CD9与其他哺乳动物CD9一样，都能有效地参与精卵质膜融合过程，而且大熊猫CD9与小鼠、人CD9基因具有相似的功能区域。此外，研究还表明大胞外环173－175的3个氨基酸残基在精卵质膜融合过程中起着重要的作用。

这些研究将有助于进一步了解大熊猫的生殖秘密，并可能促进大熊猫的保育工作，最终可能提高大熊猫的受孕能力。